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Padronização e Otimização de Métodos Analíticos para o Controle de Qualidade da Eritropoetina Humana Recombinante

A Eritropoetina é uma glicoproteína produzida pelo rim que atua como fator hormonal na formação de eritrócitos. A clonagem do gene da Eritropoetina Humana levou à produção da proteína recombinante (EPOhr) para o tratamento de anemias associadas à insuficiência renal crônica, uso terapêutico de Zidovudina, tratamentos oncológicos e redução de transfusões sanguíneas. O controle de qualidade de proteínas recombinantes requer a combinação de metodologias para a completa identificação, caracterização e avaliação da potência biológica. Dentre as metodologias preconizadas para análise da homogeneidade da EPOhr pela Farmacopéia Européia (F.E.) e pelo Centro de Inmunología Molecular (CIM), destaca-se a Focalização Isoelétrica (IEF), Eletroforese Capilar de Zona (CZE), Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência por Exclusão Molecular (SEC-CLAE) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP-CLAE). O objetivo do presente estudo foi padronizar e otimizar tais metodologias conforme recomendações da F.E. e do CIM, visando ao controle de qualidade do Insumo Farmacêutico Ativo (IFA) da EPOhr em Bio-Manguinhos. Além disso, através dessas técnicas avaliou-se uma amostra referente a um Lote Experimental contendo arginina (LEa) em comparação com a Preparação de Referência Biológica (BRP) da F.E. Assim como as demais proteínas glicosiladas, a EPOhr compreende uma mistura de isoformas relacionada ao grau de glicosilação e à presença de ácido siálico, o que foi evidenciado através das técnicas de IEF e CZE. Foram detectadas de 7 a 9 isoformas em IEF e 8 isoformas em CZE com os percentuais de cada uma de acordo com as especificações vigentes. O valor médio de PM da três amostras da EPOhr (IFA, LEa e BRP) estimado foi de 31,53 kDa através da SDSPAGE, onde detectou-se uma única banda eletroforética difusa de acordo com dados do CIM e da literatura. Além disso, os parâmetros para a validação das técnicas IEF e SDS-PAGE foram avaliados conforme a RE 899 da ANVISA e comprovam a sua reprodutibilidade. A SEC-CLAE e RP-CLAE demonstraram que a amostra analisada LEa não obteve percentual de pureza conforme as especificações da F.E. Entretanto, tais metodologias demonstraram-se eficazes e reprodutíveis para análise da pureza do produto intermediário da EPOhr, tendo em vista os perfis dos cromatogramas obtidos em concordância com as especificações e com baixa discrepância entre as réplicas. Conclui-se que após a completa validação das técnicas padronizadas no presente estudo, será possível a implantação na rotina do Controle de Qualidade em Bio-Manguinhos/Fiocruz uma adequada análise do IFA EPOhr quanto a sua homogeneidade.


Categoria de assunto

Tipo de documento

Ano de publicação

2013

Autor

  • Medeiros, Ingrid Pinheiro de