A enzima L-asparaginase é o principal medicamento biológico para tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). As formulações de L-asparaginase existentes no mercado atualmente são oriundas de sistema procariótico, Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; que são eficazes no tratamento de LLA, porém provocam toxicidade e reações de imunogenicidade que dificultam ou até inviabilizam o tratamento. Neste contexto, foi estabelecido um projeto desenvolvido em parceria entre Farmanguinhos / Fiocruz e o Instituto de Química / UFRJ, que visa o desenvolvimento de um fármaco antileucêmico a partir de asparaginase de levedura, a qual possui menor potencial imunogênico devido à maior proximidade filogenética com as células humanas. Em trabalhos anteriores, o gene ASP3 que codifica a asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae foi clonado e expresso na levedura Pichia pastoris. A extração da asparaginase periplasmática recombinante foi estudada por choque osmótico e pH alcalino usando solução de fosfato de potássio 500 mM em pH 11,5 na presença de cisteína 10 mM, na proporção de 70 mL por grama de massa celular seca, resultando em 90% de recuperação da atividade enzimática em 2 horas de tratamento. Apesar do alto rendimento e da seletividade para a extração da asparaginase, o elevado consumo de reagentes e o pH extremamente alcalino são fatores problemáticos, especialmente quando se considera o aumento de escala do processo. O presente trabalho consistiu na otimização deste processo de extração, buscando minimizar a quantidade de insumos e o tempo reacional. Os parâmetros significativos, selecionados por planejamento fatorial fracionário entre a concentração de fosfato de potássio, concentração de cisteína e pH do meio reacional, foram otimizados por delineamento composto central. Posteriormente, o tempo de reação, temperatura e proporção de solução extratora : massa celular foram avaliados separadamente. Os extratos enzimáticos foram analisados quanto à atividade enzimática, concentração de proteína total e perfil proteico por SDS-PAGE. O planejamento experimental mostrou que as três variáveis avaliadas (concentrações de fosfato e de cisteína e pH) foram significativas para a extração da asparaginase. A otimização da solução extratora indicou como composição ótima: fosfato de potássio 500 mM, cisteína 10 mM, pH 11,2, significando uma redução de 0,3 unidades de pH em relação ao processo anteriormente desenvolvido. O tempo de extração da asparaginase foi reduzido de 120 min para 60 min. A extração pode ser realizada à temperatura ambiente, entre 25 e 28° C. A proporção de volume de solução extratora : massa celular pode ser reduzida para 17,5 mL por grama de célula seca, representando uma redução de quatro vezes em relação ao processo anterior. O processo de extração otimizado foi transposto da escala de 0,1 g de célula para 0,5 g de célula sem alterações significativas no rendimento de extração e na atividade específica do extrato bruto, indicando a reprodutibilidade do processo de extração para a faixa estudada.