Parasitos do gênero Trypanosoma são capazes de infectar todas as classes de vertebrados em todos os continentes. Durante um estudo onde buscávamos detectar infecção por Leishmania spp, isolamos flagelados em baço e fígado de um Didelphis aurita proveniente do campus Fiocruz da Mata Atlântica. Observamos formas epimastigotas não compatíveis com outros tripanosomatídeos já descritos e os submetemos a caracterização biológica, morfológica e molecular. Para a análise biológica realizamos curva de crescimento e teste de viabilidade em meios de isolamento e manutenção de Trypanosoma descritos na literatura. Para a análise morfológica e morfométrica utilizamos esfregaços de cultura em fase exponencial corada pelo Giemsa; microscopia eletrônica de varredura e de transmissão A análise molecular foi realizada através de PCR (reação em cadeia da polimerase) direcionada ao gene do mini-éxon, à região parcial da subunidade menor ribossomal do gene 18S através dos marcadores 18S SSU e V7-V8, além do gGAPDH. Os produtos amplificados foram sequenciados e a edição e a construção de sequências consenso foi realizada com o programa SeqMan-DNAStar e submetidas a análise por similaridade através do algoritmo Blastn. O alinhamento das sequências foi realizado no programa Mega 5 e as árvores foram construídas utilizando as análises Neighbour-Joining (NJ) e Máxima Verossimilhança (Maximum Likellihood – ML). O resultado da análise biológica indicou que os parasitos se replicam quando mantidos em meio Schnneider acrescido de 10% SFB e 2% de urina humana masculina. A curva de crescimento durou 5 dias e apenas formas epimastigotas foram identificadas por microscopia de luz (coloração pelo método de Giemsa) e microscopia eletrônica de varredura. A análise morfométrica realizada em imagens de varredura não revelou diferenças significativas (P<0,05) entre as duas populações: comprimento total dos parasitos de 23,3±5,9μm e 28,7±6,2μm; comprimento da porção livre do flagelo de 9,5±3,2 μm e 11,6±3,0μm; e comprimento médio do corpo de 13,8±3,6μm e 17,1±3,7μm nas populações de baço e fígado, respectivamente. Como resultado da caracterização molecular, pôde-se definir que as populações de baço e fígado compunham uma mesma espécie e esta espécie apresentava maior similaridade com isolados de morcego neotropicais das Américas do Sul e Central (Trypanosoma wauwau) e espécies de Trypanosoma de marsupiais australianos. A similaridade tanto com os marsupiais australianos quanto com os morcegos neotropicais, aliada à sua posição basal no clado cruzi reacende a discussão da origem do T. cruzi e sugere que talvez as duas hipóteses atualmente apresentadas (“Southern Supercontinent” e “Bat seeding”) não sejam excludentes e sim complementares. A similaridade filogenética desta nova espécie aqui descrita com espécies de Trypanosoma descritos em marsupiais australianos indica que se trata de um parasito bastante antigo que provavelmente derivou-se de um parasito ancestral presente nos marsupiais do Supercontinente Sul. Este parasito pode posteriormente ter sido adquirido por morcegos (host-switching) e originado o que hoje conhecemos como T. wauwau. Migrações de morcegos infectados e novo hostswitching para hospedeiros terrestres (tal como proposto na “Bat seeding hypothesis”) teria originado o T. cruzi. A nova espécie de Trypanosoma aqui descrita, juntamente com o T. wauwau seriam um elo perdido, o “missing-link”, entre as duas teorias que buscam explicar a história evolutiva do gênero Trypanosoma.