O Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos - Bio-Manguinhos/ FIOCRUZ (BM) é um importante centro de produção de imunobiológicos na América Latina. Dentre as vacinas produzidas em Bio-Manguinhos, sob condições de boas práticas de fabricação, a vacina contra Febre Amarela (VcFA), produzida a partir de ovos embrionados SPF, é certificada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Organização Mundial de Saúde para suprir a demanda do Ministério da Saúde e das Agências das Nações Unidas. Para garantir a segurança da vacina assim como a ausência de agentes adventícios, testes de Controle de Qualidade (CQ) devem ser realizados na matéria-prima e nas diferentes etapas da produção. Por recomendação da Organização Mundial de Saúde, em vacinas produzidas para o uso humano deve ser demonstrada a ausência de M. orale e M. pneumoniae e quando material de origem aviária é utilizado durante a produção, ausência de M. gallisepticum e M. synoviae. Da mesma forma como o desenvolvimento de novos produtos tem evoluído, o CQ deve seguir estas novas abordagens cujos benefícios imediatos seriam a rapidez na liberação de resultados, maior sensibilidade e especificidade. O micoplasma é um importante agente adventício amplamente encontrado em diferentes tipos de substratos biológicos, porém é um microrganismo fastidioso e de difícil detecção pelo exame direto (cultura do microrganismo) o qual requer um longo prazo para obtenção de resultados, cerca de 35 dias. Em nosso trabalho selecionamos o par de oligonucleotídeos iniciadores GPO-1 e MGSO com o objetivo de estabelecer um teste para detecção de micoplasmas por PCR no CQ da VcFA. Os oligonucleotídeos selecionados amplificam fragmentos de aproximadamente 700 pb na região do gene do rDNA 16S. Foram testadas diferentes metodologias de extração de DNA, como fervura, fenol/clorofórmio e kits comerciais avaliando a adaptabilidade da técnica para os diferentes produtos intermediários. A metodologia proposta, neste trabalho, foi capaz de detectar M. pneumoniae em concentrações entre 6,25 e 3,125 UFC/mL e M. synoviae entre 12,5 e 6,25 UFC/mL, em produtos intermediários intencionalmente contaminados, em concentrações inferiores do que as preconizadas pela OMS. Além disso, os oligonucleotídeos selecionados demonstraram especificidade pelas espécies de micoplasmas utilizadas, não apresentando amplificação quando o DNA de outras espécies bacterianas foi utilizado. Paralelamente, foi realizado um ensaio de polimorfismo do comprimento dos fragmentos da restrição (RFLP) para identificação da espécie de micoplasma, onde selecionamos as enzimas de restrição MboI e HinfI, capazes de diferenciar as três espécies de micoplasmas de referência utilizadas (M. gallisepticum, M. pneumoniae e M. synoviae).