O vírus atenuado da febre amarela, subcepa 17DD, é utilizado por Bio-Manguinhos para a produção da vacina contra a febre amarela. Esta vacina tem sido empregada há anos para a imunização humana com um excelente histórico de eficácia e segurança. Para a quantificação dos títulos de anticorpos neutralizantes produzidos como resposta imunológica a vacinação é utilizada o método “ouro” PRNT - Teste de neutralização por redução de placas de lise (Plaque Reduction Neutralization Test). Entretanto, este método possui algumas particularidades que precisam ser consideradas, tais como alto custo analítico devido ao tempo requerido para a emissão de um resultado, pessoal eficientemente treinado, necessidade de equipamentos e insumos específicos não sendo, portanto, facilmente passível de uso em rotina severa ou sua utilização em grande escala. Por isso, justifica-se a necessidade de desenvolvimento de um método alternativo para a quantificação desses anticorpos. Para a implementação deste novo método alternativo torna-se necessário o desenvolvimento de um método que permita quantificar anticorpos antivírus febre amarela em amostras de soros. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um ensaio imunoenzimático para quantificação de anticorpos contra o vírus da Febre Amarela presente no soro de um grupo de indivíduos brasileiros imunizados com a vacina 17DD produzida em Bio-Manguinhos. Para este propósito, foram obtidas partículas virais da subcepa 17DD, a partir de culturas de células Vero, o anticorpo monoclonal 2D12 específico para a proteína E do envelope do vírus da FA e o soro padrão preparado in house utilizado como controle positivo (M7/100) foi obtido de macacos Rhesus (Macaca mulata). Foram utilizados diferentes soros amostrais, os quais foram titulados pelos métodos de PRNT e ViBI, onde foi possível realizar a comparação dos métodos, para avaliar a equivalência dos resultados, assim como foram realizados o estudo da validação, com os testes de seletividade, curva de calibração, precisão, exatidão, limite de quantificação e limite de detecção. Ficou demonstrado que a comparação entre os métodos ViBI e PRNT foi equivalentemente aceitável, já que quando comparados soros amostrais dos mesmos indivíduos, os resultados tiveram uma correlação alta de acordo com a avaliação realizada pelas análises estatísticas Spearman, Mann Whitney e Wilcoxon. No estudo da validação, demonstrou-se que o método ViBI pode ser utilizado para titular anticorpos que inibem a ligação do vírus da febre amarela em indivíduos sabidamente vacinados com a vacina de Febre Amarela.