Infecções pulmonares são geralmente comuns em hospedeiros imunocomprometidos. Entre as infecções pulmonares, pneumocistose, histoplasmose e criptococose são as mais importantes infecções fúngicas na população imunocomprometida, especialmente quando a contagem de células TCD4+ está abaixo de 200 células/m3 . Pneumonias fúngicas podem ser fulminantes e o diagnóstico dessas infecções pode ser difícil. O diagnóstico definitivo necessita de evidências microbiológicas ou histopatológicas, mas em alguns fungos, a cultura é demorada e pode levar de 2 a 4 semanas para se obter um resultado positivo, atrasando a decisão clínica. No diagnóstico convencional, baseado no exame direto, cultura, histopatologia ou imunocitoquímica, estes fungos são frequentemente confundidos com outros microrganismos e o diagnóstico diferencial é necessário. Métodos moleculares podem oferecer uma contribuição muito importante para o diagnóstico porque os resultados são rápidos. O objetivo principal desse trabalho foi comparar o rendimento de métodos convencionais e métodos moleculares para diagnóstico, como cultura, imunofluorescência direta, imunocitoquímica, calcofluor, Grocott e nested PCR para detectar sequencia parcial específica de Histoplasma capsulatum e Pneumocystis jirovecii e qPCR Multiplex para detectar simultaneamente sequencias de P. jirovecii, H. capsulatum e Cryptococcus neoformans. Foram analisadas 40 amostras respiratórias de indivíduos imunocomprometidos, como escarro induzido (n = 22), lavado traqueal (n = 10), lavado broncoalveolar (n = 5) e escarro espontâneo (n= 3). Comparando os resultados obtidos por essas diferentes metodologias, os métodos convencionais não se mostraram satisfatórios, não apresentando resultados positivos no calcofluor e na imunocitoquímica, somente dois resultados positivos para C. neoformans na cultura, duas amostras positivas para H. capsulatum na coloração pelo Grocott e seis amostras positivas para P. jirovecii na imunofluorescência direta. Utilizando a metodologia molecular qPCR multiplex, duas amostras foram positivas para C. neoformans, uma positiva para P. jirovecii e 11 para H. capsulatum. A nested PCR mostrou o melhor desempenho, detectando 12 amostras positivas para P. jirovecii e 28 positivas para H. capsulatum e demonstrou nove casos clínicos de coinfecção por esses fungos mostrando a importância do uso de diversas ferramentas diagnósticas para investigar a presença de possíveis agentes fúngicos. Os resultados do presente estudo foram similares aos descritos na literatura. A nested PCR foi o melhor método para detectar P. jirovecii nas amostras respiratórias e uma boa ferramenta para detectar H. capsulatum em espécimes clínicos humanos, assim como, apresentou alta sensibilidade quando comparada com métodos tradicionais